Проводка материала для обезвоживания гистология

Проводка (гистология)

Проводка — процесс дегидратации (обезвоживания) и обезжиривания фрагмента ткани и пропитки его парафином. Другими словами, жидкостная и жировая составляющая ткани замещается парафином.

Содержание

Значение проводки

Проводка обеспечивает уплотнение ткани, которое необходимо для получения срезов (если ткань будет излишне мягкой, то при микротомировании она будет «сминаться», образуя складки, разрывы и другие артефакты, делающие её непригодной к изучению). Является необходимым этапом подготовки микроскопического препарата и в большинстве случаев — наиболее долгим. [1]

Методики проводки

Дегидратация и обезжиривание

• Проводка с этиловым спиртом и ксилолом
• Проводка с этиловым спиртом и хлороформом
• Проводка с изопропанолом (чаще используют модифицированный изопропиловый спирт с присадками, например, тритоном, обеспечивающим лучшее проникновение реагента в ткани) [2] .
• Проводка с использованием толуола, бензола, ацетона и другие кустарные варианты.

Пропитка

• Пропитка чистым парафином (в настоящее время не используется, так как парафин застывает с образованием кристаллов и при резке крошится)
• Пропитка парафиновой средой (парафиновой средой называют парафин с присадками — пчелиный, рисовый воск и др.). Может изготавливаться как вручную, путем многократного расплавления и перемешивания до достижения гомогенной массы, так и в заводских условиях. [3]
• Пропитка целллоидином. Метод считается относительно устаревшим, так как пригоден не для всех типов окраски (в том числе иммуногистохимии (ИГХ).

Проводка вручную

Традиционно проводку осуществляли вручную, и в превалирующем количестве российских гистологических лабораторий метод используется до сих пор. Имеет ряд значительных недостатков: трудоемкость, длительность (до четырёх суток), испарение реагентов в воздух лаборатории (что небезопасно для сотрудников лаборатории, так как ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, вызывают острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей — дерматиты) [4] , а также нестабильное качество получаемой ткани, зависящее от человеческого фактора, а именно действий лаборанта. Кроме того, расход реагентов при проводке вручную намного выше, чем при автоматической, — как за счет испарения, так и за счет меньшей эффективности.

Автоматическая проводка

Существуют аппараты — гистопроцессоры, имеющие закрытый контур и таким образом не допускающие испарений в воздух лаборатории. Путем использования гистопроцессоров также можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом (до одного часа при использовании гистопроцессора Donatello Fast) за счет применения вакуум-инфильтрационной методики.

Источник

Обезвоживание

Промывание

Тема: Промывание и обезвоживание материала. Заливка в уплотняющие среды.

Лекция

по дисциплине «Гистология с гистологическими исследованиями»

II курс отделение «Медико-диагностическое дело»

преподаватель: Журавлева С.А.

1. Промывка материала после фиксации различными фиксаторами.

2. Значение обезвоживания. Спиртовая батарея, приготовление спиртов различной концентрации. Приготовление абсолютного спирта. Особенности проведения материала через спиртовую батарею.

3. Среды для уплотнения материала, их значение. Характеристика парафина, как заливочной среды. Подготовка парафина к заливке. Методика заливки в парафин.

Успешная фиксация исследуемого объекта — лишь первое условие, необходимое для приготовления качественных микропрепаратов. Однако для того, чтобы добиться получения тонких срезов (в тысячные доли миллиметра), зафиксированный материал необходимо соответствующим образом подготовить: сделать достаточно плотным и в то же время нехрупким. Нужно придать ему такое состояние, чтобы при резке он не крошился и не деформировался, срезался тонкими ровными слоями. Для этого ткань следует освободить от излишков фиксатора, обезвредить, пропитать и залить уплотняющей средой.

Цель этой процедуры — освободить исследуемый объект от излишнего количества фиксатора.

Способ промывания зависит от методики фиксации. Например, после фиксирующих смесей, содержащих пикриновую кислоту, дихлорид ртути, трихлоруксусную кислоту, применяют этиловый спирт разной концентрации. После фиксации в формалине, в жидкостях, содержащих хром, осмиевую кислоту, обычно употребляют воду.

В большинстве случаев промывку кусочков тканей производят в проточной водопроводной воде. Наиболее удобно это делать, помещая объект в стеклянные или фарфоровые сита, которые закрывают пробкой и опускают в сосуд с проточной водой. Пробка обеспечивает плавучесть, а отверстия — постоянную циркуляцию воды. Если кусочек не прошит ниткой, то этикетку также помещают в сито. При отсутствии сита кусочек заворачивают в марлю и подвешивают за нитку в сосуд, наполненный водой. Верх сосуда закрывают марлей и проделывают в ней небольшое отверстие. На водопроводный кран натягивают резиновый шланг или привязывают шнур (полоску бинта), свободный конец которого пропускают через марлю в сосуд и пускают по нему несильную струю воды. Среднее время промывание 20—24 ч.

Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата, следует строго придерживаться правила постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани. После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации. Для проведения процедуры приготавливают необходимое количество бюксов или стаканчиков с притертыми крышками, этикетируют их и заливают спиртами: 50, 60, 70, 80 и 96% (два стаканчика), 100% (два стаканчика). Такой последовательный ряд сосудов получил название гистологической батареи спиртов. Спирты нужной крепости приготавливают заранее по специальной таблице разведения из 96 или 95 % этилового спирта

Способ приготовления абсолютного этилового спирта.

Обычный спирт-ректификат содержит 96% чистого спирта и 4% воды. Для того чтобы получить абсолютный спирт, необходимо извлечь воду. Наиболее распространенным способом является обезвоживание при помощи прокаленного медного купороса (сульфат меди). В основе этого метода лежит свойство сульфата меди отдавать и присоединять молекулы воды, меняя при этом свой цвет (прокаленный сульфат меди имеет вид серовато-белого порошка; который по мере присоединения воды приобретает синюю окраску). Насыпав порошок прокаленного медного купороса (примерно 10 г на 100 мл спирта) в чистую стеклянную бутылку с притертой пробкой, наливают туда же 96% спирт. Затем бутылку встряхивают до равномерного распределения порошка. Подобную процедуру повторяют на протяжении 1—2 дней. По мере поглощения воды порошок приобретает синюю окраску. Однократная обработка, как правило, не дает обезвоживания, поэтому спирт переливают другой сосуд, содержащий свежую порцию сульфата меди. Подобную процедуру повторяют до тех пор, пока осадок не перестанет приобретать голубой цвет. Обезвоженный спирт отфильтровывают в чистую посуду, которую плотно закрывают. Желательно проверить рН абсолютного спирта, как после обработки сульфатом меди он может стать слегка подкисленным. Для нейтрализации достаточно прибавить небольшое количество карбоната кальция (СаСОз).

Следует помнить, что порошок медного купороса сильно раздражает слизистые оболочки. Нужно проводить прокаливание в вытяжном шкафу или же защищать слизистые оболочки носа и рта обычной марлевой маской.

Испытание абсолютного спирта на содержание воды производят опусканием в него нескольких зерен карбида кальция. Появление характерного запаха ацетилена и помутнение свидетельствуют о наличии воды. Более грубый способ — прибавление нескольких капель абсолютного спирта к 4—5 мл бензола или ксилола. Помутнение жидкости указывает на то, что спирт содержит около 3% воды.

Если препарат промывали в воде, то обезвоживание начинают с 50% спирта, если же в спиртах (после жидкости Ценкера и др.), то объект помещают в спирт последующей крепости (из 70% в 80% и т. д.). При тонких цитологических исследованиях обезвоживание начинают с 10—20% спирта. Время пребывания кусочков в отдельных спиртах определяется их величиной и свойствами. Объекты средней величины (толщиной 5 мм) достаточно держать в слабых спиртах (до 60%) по 2—4 ч, а в более крепких — от 12 до 24 ч. Мелкие и более тонкие объекты можно проводить соответственно быстрее. Для того чтобы спирт проникал в ткани равномерно со всех сторон, объект помещают на слой ваты (обычной или стеклянной) или подвешивают в стеклянном сите. При таком расположении кусочков спирт, отнимающий воду из тканей и стекающий ко дну, не мешает дальнейшему обезвоживанию.

Следует помнить, что длительное пребывание объекта в спиртах низкой концентрации приводит к мацерации тканей, в то время как передержка в спиртах высокой концентрации чрезмерно уплотняет их. Поэтому, если необходимо прервать процесс обезвоживания, то материал можно оставить на несколько дней в «индифферентном» спирте, крепость которого составляет 70-80%.

Необходимо также учитывать, что спирты в процессе обезвоживания довольно быстро загрязняются экстрагируемыми из тканей веществами и особенно жирами. Не следует использовать длительное время одни и те же спирты. Необходимо своевременно их менять.

В процессе, обезвоживая, могут быть допущены ошибки:

1) переуплотнение при полном обезвоживании;

2) нормальное уплотнение при недостаточном обезвоживании.

Оба эти недостатка являются следствием несоблюдения оптимальных условий обезвоживания и отрицательно сказываются на дальнейшей обработке материала. Достижение хороших результатов дается только опытом, поэтому необходимо тщательно регистрировать все этапы и внимательно анализировать результаты (особенно при освоении методов).

Перед тем как перенести объект в 96% или абсолютный спирт, следует придать кусочку окончательную форму и размеры (обрезать поврежденные или излишние участки). Для полного обезвоживания следует проводить материал последовательно через две порции абсолютного спирта (по 12—24 ч).

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Источник

Обезвоживание гистологического материала

библиографическое описание:
Обезвоживание гистологического материала — .

код для вставки на форум:

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ МАТЕРИАЛА

После фиксации, для которой применялся формалин, кусочки промывают в течение 6,12 или 24 ч в проточной воде: на водопроводный кран надевают резиновую трубку, конец которой опускают в широкогорлую банку, закрытую марлей. Для промывки удобно использовать эксикаторы разных размеров, снабженные краном: в отверстие крышки эксикатора опускают шланг, по кото­рому подают воду, а через кран эксикатора ее сливают.

В том случае, если в состав фиксатора входила пикриновая кислота, материал следует промыть в нескольких сменах 70% спирта, после фиксации с использованием сулемы -в йодированном 70% спирте. Материал, фиксированный для некоторых гистохимических реакций, электронно-микроскопического и иммуноцитохимического исследований, отмывают от фиксаторов в различных буферных смесях.

В случае необходимости кусочки тканей перед обезвоживанием можно уменьшить, подровнять. Если материал после фиксации не сразу подлежит проводке, то его можно оставить в 70-80% спирте.

СПОСОБЫ ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ТКАНЕЙ

Перед заливкой материала в парафин пли целлоидин его необходимо обезводить. Существует несколько традиционных способов обезвоживания. Самым распространенным является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70 %. Обычно применяют батарею спиртов, состоящую из двух порций 96 % и двух — 100 % спирта. Продолжительность процесса обезвоживания в спиртах в среднем 48 ч в зависимости от качества материала (содержания жира в ткани) и размера кусочков, а также от их количества. При использовании автомата для заливки количество спиртов увеличивают, а при проведении кусочков по спиртовой батарее вручную их осторожно промокают фильтровальной бумагой или салфеткой из марли, что позволяет реже менять спирты в батарее.

Процесс обезвоживания можно ускорить, периодически встряхивая кусочки в банках со спиртами или поместив их в термостат при 37 °С. Спирты в батарее необходимо своевременно заменять. Контролировать пригодность спирта позволяет проба с водой. В отлитое из банки небольшое количество спирта добавляют 1 каплю воды. Помутнение раствора свидетельствует о необходимости замены спирта в батарее.

Абсолютный спирт можно приготовить из 96 %. Для этого применяют сульфат меди, ко-

торый помещают в ступку и прокаливают на спиртовке или в термостате, периодически растирая и размешивая до консистенции пыли и бледно-голубого цвета. Затем сульфат меди (1 часть) засыпают в банку с 96 % спиртом (4 или 6 частей), плотно закрывают ее крышкой, взбалтывают и оставля­ют на несколько дней, периодически встряхивая. Сульфат меди адсорбирует воду из спирта и вновь приобретает синюю окраску. Перед использованием абсолютного спирта проводят его контроль спиртометром или в пробирку с небольшим количеством ксилола (4—5 мл) добавляют каплю приготовленного спирта (раствор мутнеет, если спирт недостаточно обезвожен). Хорошим адсор­бентом воды из спирта является также силикагель после предва­рительного просушивания его в термостате.

При отсутствии 100 % спирта в батарею включают еще одну порцию 96 % спирта. Однако в этом случае всегда есть опас­ность недостаточного обезвоживания и возникновения труднос­тей при получении срезов.

С целью ускорения обезвоживания применяют ацетон без примесей (ЧДА), предварительно добавив в него силикагель для удаления остатков воды или дистиллированный ацетон. Обезвоживание проводят в 2—3 сменах ацетона от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины объектов. Обезвоживание тканей возможно с помощью 99 % изопропилового спирта, который непосредственно смешивается с пара­фином без промежуточных растворителей (ксилол, хлороформ и др.). Таким же свойством обладает диоксан, однако в связи с высокой токсичностью он не нашел широкого применения в патогистологической технике

Для обезвоживания глицерином [Беккер Г.М., 1958; Wolf J., 1939, и др.] кусочки ткани последовательно помещают в 60 %, 80 % и 100 % глицерин на 3—4 ч, а затем в смесь, состоящую из равных частей 100 % глицерина и ксилола.

Выраженное влияние на скорость обезвоживания оказывает микроволновое излучение. Объекты в 70 % спирте помещают на 20 с в микроволновую печь (2,5 Гц/500 В), а затем дообезвоживают в абсолютном спирте в течение 30—60 мин.

Секционный и биопснйный материал часто обезвоживают в аппаратах типа АТ-5 и др. с последующим пропитыванием толу­олом, хлороформом или их смесью с парафином. При этом при­меняют две порции 96 % спирта и две — 100 %. Общая продол­жительность обезвоживания 48 ч. Преимущество использования аппаратов состоит в том, что в них материал постоянно переме­шивается и находится во взвешенном состоянии. Однако аппарат не включается автоматически после внезапного перепада на­пряжения в электрической сети, что может привести к пересу-шиванию большого количества материала.

похожие статьи

Атлас по судебно-медицинской гистологии / Пиголкин Ю.И., Кислов М.А., Должанский О.В., Филиппенкова Е.И., Крупин К.Н. — 2021.

Анализ недостатков судебно-гистологических исследований и пути их устранения / Гедыгушева Н.П., Буланова Э.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 47-49.

Возможности установления некоторых причин смерти гистохимическими методами / Смирнов В.В., Смирнов В.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 31-32.

Актуальные вопросы гистологического исследования при экспертизе живых лиц / Кулеша Н.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018. — №17. — С. 125-128.

Источник