Что такое парафиновая проводка

Проводка (гистология)

Проводка — процесс дегидратации (обезвоживания) и обезжиривания фрагмента ткани и пропитки его парафином. Другими словами, жидкостная и жировая составляющая ткани замещается парафином.

Содержание

Значение проводки

Проводка обеспечивает уплотнение ткани, которое необходимо для получения срезов (если ткань будет излишне мягкой, то при микротомировании она будет «сминаться», образуя складки, разрывы и другие артефакты, делающие её непригодной к изучению). Является необходимым этапом подготовки микроскопического препарата и в большинстве случаев — наиболее долгим. [1]

Методики проводки

Дегидратация и обезжиривание

• Проводка с этиловым спиртом и ксилолом
• Проводка с этиловым спиртом и хлороформом
• Проводка с изопропанолом (чаще используют модифицированный изопропиловый спирт с присадками, например, тритоном, обеспечивающим лучшее проникновение реагента в ткани) [2] .
• Проводка с использованием толуола, бензола, ацетона и другие кустарные варианты.

Пропитка

• Пропитка чистым парафином (в настоящее время не используется, так как парафин застывает с образованием кристаллов и при резке крошится)
• Пропитка парафиновой средой (парафиновой средой называют парафин с присадками — пчелиный, рисовый воск и др.). Может изготавливаться как вручную, путем многократного расплавления и перемешивания до достижения гомогенной массы, так и в заводских условиях. [3]
• Пропитка целллоидином. Метод считается относительно устаревшим, так как пригоден не для всех типов окраски (в том числе иммуногистохимии (ИГХ).

Проводка вручную

Традиционно проводку осуществляли вручную, и в превалирующем количестве российских гистологических лабораторий метод используется до сих пор. Имеет ряд значительных недостатков: трудоемкость, длительность (до четырёх суток), испарение реагентов в воздух лаборатории (что небезопасно для сотрудников лаборатории, так как ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, вызывают острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей — дерматиты) [4] , а также нестабильное качество получаемой ткани, зависящее от человеческого фактора, а именно действий лаборанта. Кроме того, расход реагентов при проводке вручную намного выше, чем при автоматической, — как за счет испарения, так и за счет меньшей эффективности.

Автоматическая проводка

Существуют аппараты — гистопроцессоры, имеющие закрытый контур и таким образом не допускающие испарений в воздух лаборатории. Путем использования гистопроцессоров также можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом (до одного часа при использовании гистопроцессора Donatello Fast) за счет применения вакуум-инфильтрационной методики.

Источник

Проводка изопропанол-парафин. Ручной и автоматический методы

Здравствуйте, коллеги!
С вами просветляющая рубрика «Образователь»

Часто те, кто используют изопропанол в проводке, задают вопрос: может ли дегидратант (изопропанол) заменить промежуточную среду, или просветлитель (ксилол, толуол, масло и т.д.)?
Отвечаем: не может. Функции у дегидратанта и просветлителя разные, а выполняют их вещества из совершенно разных химических классов. Промежуточная среда нужна не только для осуществления перехода между спиртом и парафином, основная её роль — просветление тканей, то есть подготовка их к пропитыванию парафином. Если ткани непросветлённые, они хуже пропитываются парафином, и возникают проблемы при резке. Особенно это заметно на жировой ткани.

Тем не менее, в некоторых лабораториях существует проводка изопропанол-парафин, и в этой статье мы приведём примеры такой проводки.

Проводка изопропанол-парафин

Большинство деликатных тканей удается провести таким способом и получить вполне пригодные для диагностики препараты. Это эндоскопические биоптаты, лимфоузлы, гинекологические соскобы, фрагменты слизистых оболочек, эмбрионы ранних сроков. Однако, очень часто получаются неудовлетворительные результаты для традиционно «трудных тканей», таких как жир, кишка, матка, кожа, опухоли из мышечной и соединительной ткани, кости. Поэтому прежде, чем запускать такой протокол в рутинную работу, проверьте, будет ли в ваших условиях достижим желаемый результат.

Изопропанол, в отличие от этанола, смешивается с парафином, поэтому многие считают, что промежуточная среда не нужна. Способность изопропанола смешиваться с расплавленным парафином известна благодаря тому, что при температуре выше 25оС он может находиться в области неполярных жидкостей, и благодаря этому хорошо смешивается с расплавленным парафином. Но здесь важно знать, что изопропанол никак не заменяет ксилол или любой другой просветлитель. Изопропанол удаляет из тканей воду, денатурирует большинство белков и растворяет большую часть жиров, но не просветляет ткани, так как его коэффициент преломления далек от ксилола и его аналогов.

Имеется два способа удаления изопропанола из тканей:
1. Увеличение температуры выше 65, вплоть до 82оС, выше начинается выкипание и испарение его из тканей и парафина, но такая температура ведёт к необратимому повреждению тканей.
2. Увеличение времени в расплавленном парафине. При таком способе удлиняется протокол проводки и время действия горячего парафина, что переуплотняет ткани.

Изопропанол на рынке зачастую продается под разными торговыми названиями. Торговые марки очень часто содержат более 96% изопропанола и малую часть различных добавок (неоинные ПАВ, метанол, высшие спирты), которые практически не влияют на качество проводки.

Варианты проводки на изопропанол-парафине

Эндоскопические биоптаты. Ручной метод

1. Изопропанол 30 мин
   2. Изопропанол 30 мин
   3. Изопропанол 30 мин
   4. Парафин 30 мин
   5. Парафин 30 мин
   6. Парафин 30 мин

Хирургические образцы. Ручной метод

1. Изопропанол 2 часа
   2. Изопропанол 2 часа
   3. Изопропанол 2 часа
   4. Изопропанол 2 часа
   5. Изопропанол 16 час (ночь или выходные)
   6. Парафин 2 часа
   7. Парафин 2 часа
   8. Парафин 2 часа

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 1 корзина, 2 парафина

1. Изопропанол 15 мин
   2. Изопропанол 15 мин
   3. Изопропанол 15 мин
   4. Изопропанол 15 мин
   5. Изопропанол 15 мин
   6. Парафин 1 час
   7. Парафин 1 час

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 1 корзина, 3 парафина

1. Изопропанол 15 мин
   2. Изопропанол 15 мин
   3. Изопропанол 15 мин
   4. Изопропанол 15 мин
   5. Изопропанол 15 мин
   6. Парафин 30 мин
   7. Парафин 1 час
   8. Парафин 1 час

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 2 корзины, 2 парафина

1. Изопропанол 15 мин
   2. Изопропанол 15 мин
   3. Изопропанол 15 мин
   4. Изопропанол 15 мин
   5. Изопропанол 15 мин
   6. Парафин 1 час
   7. Парафин 1 час (вторую корзину необходимо задержать дополнительно в парафине на 1 час)

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 2 корзины, 3 парафина

1. Изопропанол 15 мин
   2. Изопропанол 15 мин
   3. Изопропанол 15 мин
   4. Изопропанол 15 мин
   5. Изопропанол 15 мин
   6. Парафин 30 мин
   7. Парафин 1 час
   8. Парафин 1 час (вторую корзину необходимо держать дополнительно в парафине в течение 1 часа)

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 1 корзина, 2 парафина

1. Изопропанол 2 час
   2. Изопропанол 2 час
   3. Изопропанол 2 час
   4. Изопропанол 2 час
   5. Изопропанол 2 час
   6. Парафин 3 часа
   7. Парафин 3 часа

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 1 корзина, 3 парафина

1. Изопропанол 2 час
   2. Изопропанол 2 час
   3. Изопропанол 2 час
   4. Изопропанол 2 час
   5. Изопропанол 2 час
   6. Парафин 2 часа
   7. Парафин 2 часа
   8. Парафин 2 часа

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 2 корзины, 2 парафина

1. Изопропанол 2 час
   2. Изопропанол 2 час
   3. Изопропанол 2 час
   4. Изопропанол 2 час
   5. Изопропанол 2 час
   6. Парафин 3 часа
   7. Парафин 3 часа
   Вторую партию перед заливкой необходимо выдержать 3 часа во втором парафине.

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 2 корзины, 3 парафина

1. Изопропанол 2 час
   2. Изопропанол 2 час
   3. Изопропанол 2 час
   4. Изопропанол 2 час
   5. Изопропанол 2 час
   6. Парафин 2 часа
   7. Парафин 2 часа
   8. Парафин 2 часа

Вторую партию перед заливкой необходимо выдержать 2 часа в третьем парафине.

Источник

Заливка гистологического материала

библиографическое описание:
Заливка гистологического материала — .

код для вставки на форум:

ЗАЛИВОЧНЫЕ СРЕДЫ

Для получения тонких (до 6 мкм) гистологических срезов необ­ходимо фиксированный и промытый материал залить в плот­ную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В за­висимости от способа растворения все заливочные среды разде­ляют на растворимые в органических растворителях и водорас­творимые. К первым относятся парафин, пластические полиме­ры на основе парафина, целлоидин, ко вторым — желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты и т.д.

1.Заливка ткани в парафин

Парафин — смесь высокомолекулярных предельных углеводо­родов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бен­золе, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлорэтилене, кси­лоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в ка­честве промежуточной среды между спиртом и парафином. Тем­пература плавления различных парафинов от 27 до 62 °С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56 °С. Зарубежные фирмы производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий раз­личные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид. Их коммерческие названия «Парапласт», «Парапласт плюс», «Гистопласт С», «Гистозес».

Важнейшим условием успешной заливки материала является своевременная смена реактивов в процессе их загрязнения, а также соблюдение рекомендуемых временных и температурных параметров. Кроме того, нужно стремиться к тому, чтобы одновременно заливать одинаковые по толщине и плотности кусочки ткани.

формалин 10 % 24 ч

спирт-формол 24 ч

жидкость Карнуа 2 – 4 ч

спирт 96-100% 2 – 24 ч

проточной воде 12 — 24 ч

спирт 96 % I 24 ч

спирт 96 %II 2 ч

спирт 100 % I 24 ч

спирт 100 % II 2 ч

спирт 50% 2 — 4 ч

спирт 60 % 2 — 4ч

спирт70% 12 — 24ч

спирт 96 %I 12 ч

спирт 96 % II 12 ч

спирт 100 % I 1-12 ч

спирт 100 % II 12 ч

Заливка в парафин:

спирт+хлороформ (1:1) 6-12ч

или спнрт+ксилол (1:1) 1-3ч

или хлороформ 6-12ч

хлороформ+парафин (1:1 — «каша») 37 «С 2-3ч

или ксилол+парафин (1:1 — «каша») 37 °С 1-2ч

napaфин I 56 °С 2ч

парафин II 56 °С 1ч

спирт 100 % + хлороформ (1:1) 2-3ч

хлороформ I 1,5ч

хлороформ II 0,5ч

хлороформ III 0,5ч

хлороформ+парафин (1:1) 37°С 3-6ч

хлороформ+парафин (1:1) 56°С 0,5-1ч

парафин I 56°С 2ч

парафин II 56°С 2ч

парафин III 56°С 1ч

Другие способы заливки.

Заливка по Ромейсу ручным способом

Заливка по Ромейсу ручным способом

Заливка в парапласт с помощью автомата

Заливка в парапласт с помощью вакуум-автомата.

Быстрая заливка в парапласт с помощью автомата

Фиксация 10% формалин 12ч

10% формалин 12ч

Фиксация в 5 % формалине 2ч

Фиксация в 5 % формалине при 60 °С 10мин

Промывание в проточной воде 2ч

Промывание в проточной воде 2ч

50% изопропиловый спирт 2ч

Спирт 70 % II 1ч

Спирт 96 % II 1ч

Ацетон IV 30мин

100% Изопропиловый спирт I 4ч

Спирт 100 % I 1ч

Спирт 100 % II 1ч

Метилбензоат I 2ч

Спирт 100 % III 1ч

Спирт 100 «о III

Метилбензоат II 2ч

Хлороформ I (бензол) 1ч

Ацетон-ксилол (1:1) 10мин

Хлороформ II (бензол) 1ч

Парапласт I 60 °С 2ч

Парапласт плюс I 60 °С 15мин

Парапласт П 60 ‘С 3ч

Парапласт плюс II 60 °С

Парапласт плюс 60 °С 30мин

Наиболее быстрым, простым, не требующим применения специальной аппаратуры методом заливки материала является способ, разработанный И. И. Золотых в патологоанатомическом отделении Института хирургии им. А. В. Вишневского.

96 % спирте 15 мин

100 % Спирт 15 мин

Хлороформ 15 мин

Хлороформ-парафин при 56 °С 15 мин

Парафин при 56 °С, энергично встряхивая 1 мин

Парафин при 56 °С 45 мин

Продолжительность 2 ч 30 мин

У нас заливка проходит следующим образом:

Формалин 10% 24 часа

Промывка проточной водой 1 час

спирт 70% (обезвоживание) больше 4 часов

спирт 80% больше 4 часов

спирт 96% больше 4 часов

спирт+хлороформ 1:1 до 1 часа(пересушивается)

хлороформ чистый до 1 часа

хлороформ чистый до 1 часа

хлороформ+парафин 1:1 37С до 1 часа

парафин 1 56С 45 м

парафин 2 56С 45 м

Для приготовления препаратов следует:

ксилол 1 (депарафинизация) 56С 10 м

ксилол 2 56С 10 м

гематоксилин 5 м

промываем дистиллированной водой

ксилол 56С больше 10 м (для просветления)

Особенности заливки в парафин крупных объектов

Заливка в парафин позволяет получать гистологические срезы больших размеров (гистотопографические срезы), например срезы всего органа (матка, почка) или его значительной части (доля легкого). Заливку проводят вручную, и для нее требуется дополнительное время на всех этапах. Для приготовления таких срезов из ткани головного мозга с помощью мозгового ножа де­лают срез свежей ткани толщиной около 1 см и закладывают в ванну с фиксатором. Для того чтобы сохранить плоскую конфи­гурацию среза, его кладут между двумя проволочными сетками, которые притягивают друг к другу резиновыми кольцами. Про­должительность фиксации 48 ч. После промывки в проточной воде (3—4 ч) следует обезвоживание в 70 %, 96 % и 100 % спир­те (по 2 смены) в течение 48 ч. Для обезвоживания можно при­менить изопропиловый спирт, обеспечивая частую его смену и температуру 45 °С (в термостате). Это позволяет избежать по­лучения чрезмерно жестких препаратов. В качестве промежу­точной среды используют метилбензоат или хлороформ — 3 смены по 3 дня. Объекты заливают в парафин или парапласт, имеющие температуру плавления 56—58 °С.

Приготовление парафиновых блоков

Пропитанные парафином кусочки ткани выкладывают в специ­альные формочки и заливают расплавленным в термостате или на водяной бане при 60 °С парафином, в который добавлено 1 — 3 % воска.

Для получения парафиновых блоков нужной формы исполь­зуют различные приспособления. К ним относятся изготовляе­мые самим лаборантом бумажные коробочки, на дно которых выкладывают кусочки, а рядом к боковой стенке ставят этикет­ку номером кнаружи; металлические Г-образные угольники или разъемные формочки, которые перед употреблением смазывают глицерином и помещают на нагретую металлическую пластин­ку, выполняющую роль дна формочек. Применяют также раз­личные пластмассовые коробочки и формы, в частности используемые в микробиологии, особенно при заливке мелких объек­тов, таких как материал пункционных биопсий.

Специальные импортные аппараты для заливки в парафин (так называемые заливочные центры) снабжены набором раз­личных формочек (кассет) и пинцетов. В них обеспечивается автоматическая подача дробных доз парафина оптимальной температуры.

Раскладывание кусочков в формочки и их ориентирование нужно проводить быстро теплым пинцетом. Если материала для заливки много и он быстро остывает, то можно использовать пара­фин, подогретый на водяной бане до 60 °С. Для охлаждения фор­мочки с материалом рекомендуют помещать в воду при 10— 18 °С, но не погружать в нее. При застывании парафина поверхность блока стягивается, и в нем образуется кратерообразное углубление. Это нужно учитывать при заливке кусочков и в дальнейшей работе с блоками. Парафин должен на 3—4 мм выступать над по­верхностью блока, если предстоит монтировать его на деревянную колодку. Возможны также заливка блока большим количеством парафина и резка без использования деревянных колодок, с успе­хом применяемая даже на санном микротоме.

В большинстве руководств рекомендуют после подравнивания и удаления лишнего парафина наклеивать блоки на дере­вянные бруски с помощью подогретого на спиртовке металли­ческого шпателя или скальпеля. Затем для обеспечения более прочного приклеивания основания блок оплавляют с четырех боковых сторон тем же горячим шпателем или скальпелем.

Заливка ткани в целлоидин

Целлоидин — хорошо растворяющаяся в эфире нитроклетчат­ка. В гистологической практике применяют 2 %, 4 % и 8 % рас­творы целлоидина, которые готовят из целлоидиновых пластин или отмытой от эмульсии и высушенной рентгеновской пленки.

Для приготовления 500 мл 2 % раствора целлоидина 10 г сухого целлоидина заливают 250 мл 100 % спирта и оставляют на 1 сут, затем добавляют 250 мл безводного эфира, который растворяет набухший в спирте целлоидин. Для приготовления 4 % и 8 % растворов количество целлоидина увеличивают со­ответственно в 2 и 4 раза. Растворы хранят в плотно закрытой посуде.

Заливка ткани в целлоидин стала в настоящее время менее популярной, чем парафиновая, и ее применяют главным обра­зом для обработки труднорежущихся тканей и объектов боль­ших размеров, с которых трудно получить хорошие парафино­вые срезы. Целлоидиновую заливку используют также в тех случаях, когда необходимо избежать воздействия на исследуе­мый материал высоких температур. Кроме того, заливка мате­риалов в целлоидин позволяет получить лучшие результаты при наличии в объектах больших полостей, лакун и слоев различ­ной консистенции.

Эфир и сухой целлоидин огнеопасны, поэтому при работе с ними необходима осторожность.

Обезвоженный материал помещают в смесь 100 % спирта с эфиром (1:1) на 4—6ч, переносят в 2 % раствор целлоидина на 2—3 дня, затем в 4 % и 8 % растворы на 5—7 дней в каждый. Пропитанный кусочек заливают свежим 8 % целлоидином и уп­лотняют в парах хлороформа (в эксикаторе). Уплотненный таким образом материал заливают 70 % спиртом для хранения. Вырезанные блоки наклеивают густым целлоидином на дере­вянные колодки на 1 суток перед резкой.

Источник